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體外診斷試劑參考區(qū)間確定注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導醫(yī)療器械注冊申請人對注冊申報資料中參考區(qū)間研究資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是對體外診斷試劑參考區(qū)間確定的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是供醫(yī)療器械注冊申請人和技術審評人員使用的指導文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將適時進行調整。

一、適用范圍

本指導原則適用于定量檢測體外診斷試劑參考區(qū)間的確定研究。本文主要討論健康人群相關的參考區(qū)間，申請人也可用類似方法建立其他類型參考人群的參考區(qū)間，如其他特定生理或病理條件的參考區(qū)間。

本指導原則不適用于定性和半定量檢測試劑；不適用于藥物濃度監(jiān)測用途的檢測試劑；不適用于致病性病原體相關檢測試劑；不適用于醫(yī)學決定水平的確定。已經(jīng)有國內(nèi)公認、統(tǒng)一的參考區(qū)間和醫(yī)學決定水平的檢測項目，可不再建立參考區(qū)間，此類產(chǎn)品應將評估重點放在標準化方面。

本指導原則適用于進行相關產(chǎn)品注冊和變更注冊的體外診斷試劑參考區(qū)間確定，包括申報資料中的部分要求，其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督管理總局令48號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規(guī)要求。

二、基本原則

應按照以下情況,分別選擇建立和驗證的方式確定申報產(chǎn)品的參考區(qū)間：

1.首個申報產(chǎn)品（境內(nèi)無同類已批準上市注冊產(chǎn)品）

1.1境內(nèi)申報產(chǎn)品應通過建立的方法，確定申報產(chǎn)品的參考區(qū)間。

1.2進口申報產(chǎn)品，如在境外申請人注冊地或者生產(chǎn)地所在國家（地區(qū)）已批準上市，申請人需驗證申報產(chǎn)品說明書載明的參考區(qū)間的適用性。如驗證不通過，需建立適用于中國人群的參考區(qū)間。未在境外申請人注冊地或生產(chǎn)地所在國家（地區(qū)）上市的創(chuàng)新醫(yī)療器械，應建立包含中國人群參考區(qū)間。

2.國內(nèi)已有同類產(chǎn)品批準上市的申報產(chǎn)品，可選擇自行建立參考區(qū)間，也可以選擇驗證該產(chǎn)品境外注冊試劑說明書中的參考區(qū)間（進口注冊適用），或其他國內(nèi)已注冊產(chǎn)品參考區(qū)間，但應首選注冊申報中臨床試驗或臨床評價中方法學比對時，所選擇的對比試劑的參考區(qū)間進行驗證。如驗證通過，可直接采用經(jīng)驗證的參考區(qū)間；如驗證不通過，應建立參考區(qū)間。

上述參考區(qū)間的驗證應滿足下文“（二）參考區(qū)間的驗證”章節(jié)相關條件；參考區(qū)間的建立應滿足下文“（一）參考區(qū)間的建立”章節(jié)相關要求。

三、技術審查要點

（一）參考區(qū)間的建立

1.參考樣本組的選擇

1.1制定參考個體的選擇標準

篩選參考個體時，應首先確定檢測項目的適用人群，除成年表觀健康人外，適用時，也應考慮納入未成年人（如評估生長發(fā)育的指標）或老年人（如評估衰老相關疾病的指標），絕經(jīng)前和絕經(jīng)后表觀健康女性個體（如部分女性相關腫瘤標志物、骨代謝標志物等），不同月經(jīng)周期女性（如性激素）等；對于特定體液樣本類型，如腦脊液，可考慮將非相關病理人群的特定評估指標作為參考個體的篩選標準。應根據(jù)申報產(chǎn)品個性化定義“表觀健康”，評估可能的生理及病理影響因素，據(jù)此設定明確的納入、排除標準。應依據(jù)納入、排除標準設計參考個體調查問卷，并采取必要的措施保證問卷填寫的準確、客觀。

綜上，針對不同檢測項目參考個體的排除標準也不盡相同，表1中列出應予以考慮的部分排除因素，申請人應根據(jù)檢測項目的不同，增加或減少排除標準。

表1 參考個體選擇應考慮的排除因素

1.2制定參考個體的分組標準

根據(jù)所篩選參考個體的特征，考慮其是否對臨床決策具有意義等情況，對其進行分組。研究者應根據(jù)檢測項目的不同，合理設計分組條件。潛在分組條件可以是年齡、性別、血型、種族、晝夜節(jié)律、飲食、吸煙、運動、月經(jīng)周期、妊娠階段、采樣時間、地理位置、職業(yè)等因素。

1.3 參考個體的選擇

參考個體選擇時，應按照明確的標準采用直接抽樣的方式進行選擇。參考個體應盡可能接近檢測項目的臨床患者分布組成，盡可能涵蓋各年齡組內(nèi)不同年齡段，且男女個體數(shù)量應相當(適用時），地域選擇應具有代表性。參考個體分布特征應盡量接近社區(qū)人群分布。注冊申請人根據(jù)產(chǎn)品特點設計納入、排除標準，將符合標準的具有人群代表性的個體納入?yún)⒖既巳?。建議通過多中心招募的形式納入?yún)⒖既巳骸?/p>

2.樣本采集與處理

2.1參考個體準備

參考個體的狀態(tài)指對檢測項目結果具有影響的狀態(tài)。樣本采集前進食會對許多檢測項目有直接（濃度改變）或間接（脂類物質干擾）的影響，長期節(jié)食也會造成許多檢測指標的改變。另外，咖啡因、酒精、香煙和維生素C等，也會對許多檢測項目的檢測結果產(chǎn)生影響。因此，應該對參考個體各項可能產(chǎn)生影響的因素（表2）進行評價，保證狀態(tài)良好方可進行樣本的采集。

表2 參考個體的狀態(tài)因素

2.2樣本的采集、處理和儲存

影響參考樣本采集、處理和儲存的因素包括采樣環(huán)境、采樣時間、采樣體位、樣本類型、運送方式、樣本狀態(tài)、樣本分離、儲存方式等。申請人應采用符合說明書聲稱要求的樣本進行參考區(qū)間研究，并在研究報告中詳細說明樣本類型、儲存方式等情況。如檢測采用血液樣本，應區(qū)分動脈血、靜脈血及毛細血管血；如需使用抗凝劑，需明確抗凝劑的類型；如采集尿液樣本應明確取樣時間段（如適用）。

3.樣本檢測

應采用檢測系統(tǒng)進行參考樣本的檢測。檢測系統(tǒng)包括樣本處理用產(chǎn)品、檢測試劑、校準品、質控品、檢測設備等。

4.數(shù)據(jù)分析

依據(jù)臨床意義的不同，參考區(qū)間研究需要確定檢測項目的單側界值或雙側界值。通常使用雙側2.5%～97.5%人群分布，單側時可選擇95%或5%。

4.1參考樣本數(shù)量

研究至少需要120例參考樣本,此時可對參考限的90%置信區(qū)間進行準確估計。參考限的置信區(qū)間不同，所需參考樣本量也不盡相同，具體見表3。如需分組評估，則每組均需要滿足相應置信區(qū)間的參考樣本量要求。如有離群值，則應在剔除離群值后補足相應參考樣本例數(shù)。 

表3 95%參考區(qū)間的不同置信區(qū)間最少樣本數(shù)量

 4.2繪制分布圖

繪制分布圖用以了解數(shù)據(jù)分布特征，并對數(shù)據(jù)進行審查。

為了解數(shù)據(jù)的分布特性，需對數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布進行判斷，即數(shù)據(jù)對稱性和正態(tài)峰的判斷。數(shù)據(jù)對稱性和正態(tài)峰的判斷可通過直方圖、正態(tài)概率圖，或采用假設檢驗的方法進行綜合判斷，常用的假設檢驗方法有矩法、W檢驗法、KS檢驗法等。

4.3數(shù)據(jù)離群值的判斷

申請人應采用合理的統(tǒng)計分析方法進行離群值的判定。此處推薦兩種方法：

4.3.1 Dixon方法（適用于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)）

4.3.1.1在參考值檢測數(shù)據(jù)中，如果有疑似離群數(shù)據(jù)，應將疑似離群值的檢測結果和其相鄰值的差D和數(shù)據(jù)（包含疑似離群值）全距R相除，若D/R≥1/3考慮為離群值。

4.3.1.2若同側有2個或以上疑似離群點，可從最小的疑似離群點起作如上處理，若D/R都大于1/3，則所有疑似點都定義為離群值；若D/R都小于1/3，則保留所有疑似數(shù)據(jù)。

4.3.2 Tukey法（適用于正態(tài)分布數(shù)據(jù)）

4.3.2.1 計算數(shù)據(jù)集的四分位數(shù)，定義為Q3（75%分位數(shù)）和Q1（25%分位數(shù)）。計算四分位間距，定義為IQR(Q3-Q1)。將大于四分位間距上限：Q3+1.5×IQR或小于四分位間距下限：Q1-1.5×IQR的參考值定義為離群值。

4.3.3如出現(xiàn)離群值，應對離群值產(chǎn)生原因進行分析，如果有明確的原因，如檢測時操作錯誤等，可將離群值剔除，如無明確原因，應將該數(shù)據(jù)保留。

4.4數(shù)據(jù)分組

數(shù)據(jù)是否需要分組，需根據(jù)參考區(qū)間分組是否對臨床決策具有意義或檢測項目具有明確的生理學意義，且必須對不同亞組之間的差別進行統(tǒng)計學假設檢驗，檢驗結果應顯示差異有統(tǒng)計學意義。

申請人應結合數(shù)據(jù)分布特征選擇適當?shù)慕y(tǒng)計假設方法進行數(shù)據(jù)分組判定。如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，申請人可采用Z檢驗，確定分組后的均值間差異有無統(tǒng)計上的顯著性。

式中，

1——第一組參考值的均值

2——第二組參考值的均值

s1 ——第一組參考值的標準差

s2 ——第二組參考值的標準差

n1——第一組參考值的數(shù)量

n2 ——第二組參考值的數(shù)量

n——平均樣本量

如s2＞1.5s1或s2/（s2-s1）＜3時，可以考慮分組；如計算Z值超過Z*時，也可考慮成分組。

4.5建立參考區(qū)間

依據(jù)數(shù)據(jù)分布特征，計算參考區(qū)間的常用方法包括參數(shù)法和非參數(shù)法。

4.5.1經(jīng)正態(tài)性檢驗后，如參考值數(shù)據(jù)近似正態(tài)分布或檢測數(shù)據(jù)經(jīng)變量轉換后呈正態(tài)分布，可采用正態(tài)分布法確定參考區(qū)間，樣本量要求見表3。用該方法確定的參考區(qū)間所得結果穩(wěn)定，受兩端數(shù)據(jù)影響較小。

可采用下述公式進行參考區(qū)間的計算：

雙側1-α參考區(qū)間：`X±Z1-α/2S

單側1-α參考區(qū)間：＞`X -Z1-αS或＜`X＋Z1-αS

式中`X為均數(shù)，S為標準差。

4.5.2經(jīng)正態(tài)性檢驗后，如參考值數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，可采用百分位數(shù)法（非參數(shù)法）確定參考區(qū)間，樣本量要求見表3。該方法受兩端數(shù)據(jù)影響較大，樣本含量較小時結果不穩(wěn)定、不宜選用。將n個參考個體檢測值按照從小到大的順序排列，并依次編上秩次。把n個秩次分為100等分，與r%秩次對應的數(shù)稱為第r百分位數(shù)，用Pr表示。分別計算參考值下限r(nóng)1（2.5百分位數(shù)）和參考值上限r(nóng)2（97.5百分位數(shù)）作為檢測項目的95%參考區(qū)間。還需計算參考限的90%或95%置信區(qū)間。若r值計算值不是整數(shù)，可將它們四舍五入后取整。

（二）參考區(qū)間的驗證

1.驗證條件

采用驗證的方法確定申報試劑參考區(qū)間時，需要滿足以下條件：第一，原始參考區(qū)間的研究應系統(tǒng)全面，具有可信性，如已發(fā)布實施的臨床檢測參考區(qū)間標準等;第二，檢測系統(tǒng)需具有可比性；第三，參考區(qū)間研究的分析前因素需具有可比性，如參考個體的狀態(tài)，標本采集和處理程序等; 第四，參考人群的適宜性。原始參考區(qū)間研究所采用的參考人群應在人群分布的地理位置、人口統(tǒng)計學特征等方面與申報試劑預期適用人群相一致，或包含符合參考區(qū)間建立參考樣本數(shù)量要求的上述參考人群。如不能同時滿足上述條件，申請人需按照前文所述方法建立自己的參考區(qū)間。

申請人應通過方法學比對的方法，對申報產(chǎn)品與原始參考區(qū)間建立時的檢測系統(tǒng)的可比性進行研究。方法學比對研究方法，可參考《免于臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價技術指導原則》（國家藥品監(jiān)督管理局2021第74號公告）。注意兩檢測系統(tǒng)檢測結果應具有高度一致性。申請人應通過列表的方式，對比參考人群分布的地理位置、生物特征、參考區(qū)間研究分析前的因素等。

2.參考區(qū)間的驗證

申請人應選擇至少20例與申報產(chǎn)品預期使用人群地理分布和人口統(tǒng)計學特征相似的參考個體，在具有與原始參考區(qū)間研究一致的分析前因素和相同的檢測條件下，研究小樣本人群的參考值。比較小樣本參考值和原始參考區(qū)間之間的可比性。如果20例參考個體中只有不超過2例的參考值超出原始參考區(qū)間，即通過驗證，可以直接使用原始參考區(qū)間。如參考個體多于20例，則超出原始參考區(qū)間的數(shù)據(jù)不超過檢測結果的10%，即通過驗證；若有10%以上的數(shù)據(jù)超出原始參考區(qū)間，則應另選至少20例參考個體，重新按照上述判斷標準進行驗證。若參考區(qū)間驗證使用了其他參考界值，則對應的驗證標準需滿足統(tǒng)計學要求的。若驗證結果符合要求，可直接使用原始參考區(qū)間，反之則應檢查所有的分析程序，考慮樣本是否有生物學差異，并按照前文所述方法建立自己的參考區(qū)間。

在統(tǒng)計學上，隨著樣本量的增加，利用統(tǒng)計原理發(fā)現(xiàn)人群差異的能力更強。因此，申請人可以加大參考個體的樣本量，如采用60例樣本，并將測得的參考值與原始參考區(qū)間比較，判斷參考值和原始參考區(qū)間之間是否具有可比性。

（三）說明書

申請人應在說明書【參考區(qū)間】中載明經(jīng)研究確定的參考區(qū)間。此部分內(nèi)容應包含參考區(qū)間確定的基本信息，包括：樣本量、參考人群特征（如性別、年齡、種族等）和參考區(qū)間確定采用的統(tǒng)計學方法。

四、其他應注意的問題

無論是建立自己的參考區(qū)間或驗證參考區(qū)間，都要確保參考區(qū)間的可溯源性，記錄確定參考區(qū)間的所有步驟，包括參考個體的選擇、分析前因素、樣本檢測以及統(tǒng)計分析方法等。

五、名詞解釋

1.參考個體（reference individual）：根據(jù)明確標準選擇出進行實驗的個體。通常是符合特定標準的健康個體。

2. 參考人群（reference population）：由所有參考個體組成的群體。

注：通常情況下參考人群中的個體數(shù)是未知的，因此參考人群是一個假設實體。

3.參考樣本組（reference sample group）：從參考人群中選出的用以代表參考人群的足夠數(shù)量的個體。

4.參考值（reference value）：通過對參考個體某一特定量進行觀察或測量而得到的值（檢驗結果）。

5.參考分布（reference distribution）：一組參考值的分布。

6.參考限（reference limit）：源自參考值的分布，用于描述部分參考值的位置（小于或等于、大于或等于、上限/下限）。

7.參考區(qū)間（reference interval）：來自生物參考人群的數(shù)值的特定分布區(qū)間。

注：在有些情況下，只有一端的生物學參考界限是重要的，通常是上限“x”，相應的參考區(qū)間將是小于或等于“x”。

六、參考文獻

[1] GB/T 29791.1-2013，體外診斷醫(yī)療器械制造商提供的信息（標示）第1部分：術語、定義和通用要求[S].

[2] CLSI. Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guideline—Third Edition. CLSI document EP28-A3c. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010.

[3] WS/T 402-2012，臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定[S].

[4] WS/T 780-2021，兒童臨床常用生化檢驗項目參考區(qū)間[S].