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寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則

（征求意見(jiàn)稿） 

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供體外診斷試劑注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

寨卡病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，呈球形，直徑約為40-70nm，有包膜?；蚪M為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為10.8Kb，兩端為非編碼區(qū)，內(nèi)部的單一開放讀碼框依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，包括衣殼蛋白（C）、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）、包膜蛋白（E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5），根據(jù)基因組序列不同分為亞洲型和非洲型兩個(gè)基因型。

寨卡病毒病的檢測(cè)方法包括病毒核酸檢測(cè)、病毒抗原檢測(cè)、IgM和IgG抗體檢測(cè)、中和抗體檢測(cè)和病毒分離培養(yǎng)等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前主要采用病毒核酸檢測(cè)。核酸檢測(cè)主要采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR、恒溫?cái)U(kuò)增等方法，檢測(cè)樣本類型包括血清、血漿、尿液、精液或唾液等。

本指導(dǎo)原則適用于采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR法，對(duì)血清、血漿、尿液、精液或唾液等樣本中的寨卡病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑。

對(duì)于采用其他方法學(xué)的寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人應(yīng)參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，并補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料。

本指導(dǎo)原則適用于寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申請(qǐng)和變更注冊(cè)申請(qǐng)的情形。本指導(dǎo)原則針對(duì)寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測(cè)流程。提供不同適用機(jī)型的檢測(cè)通量，即一次檢測(cè)最多可檢測(cè)的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣?dòng)提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測(cè)全過(guò)程所需的時(shí)間。不同檢測(cè)流程，分別提供最少和最多檢測(cè)樣本量下的檢測(cè)時(shí)間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測(cè)原理，檢測(cè)靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測(cè)的靶基因，需選擇保守性和特異性相對(duì)較高的基因，同時(shí)還應(yīng)考慮基因的擴(kuò)增效率。檢測(cè)基因的選擇應(yīng)提供相關(guān)指南或文獻(xiàn)，并分析所檢測(cè)基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

如有適用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評(píng)估的資料。如申報(bào)產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對(duì)各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗(yàn)證。

適用的不同樣本類型應(yīng)分別進(jìn)行分析性能研究。

分析性能評(píng)估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的寨卡病毒陽(yáng)性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽(yáng)性和濃度水平，提交具體的試驗(yàn)資料。建議采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品建立校準(zhǔn)曲線的方法確定研究樣本的濃度。分析性能評(píng)估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本，如涉及稀釋后檢測(cè)，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒、假病毒或體外轉(zhuǎn)錄RNA等，進(jìn)行分析性能評(píng)估。對(duì)于各項(xiàng)性能中采用的樣本，在下述各項(xiàng)性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應(yīng)相互獨(dú)立。

2.1樣本穩(wěn)定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行詳細(xì)研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，滅活處理后的樣本，研究?jī)?nèi)容包括冷藏保存時(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。

建議對(duì)每種樣本類型均進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測(cè)，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

2.2適用的樣本類型

列表列明產(chǎn)品適用的樣本類型。

對(duì)于血清和血漿樣本類型，可選擇有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的樣本進(jìn)行樣本一致性的同源比對(duì)研究。研究樣本應(yīng)包含陰性、高值陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性等不同性質(zhì)和濃度水平。

如產(chǎn)品適用于其他樣本類型，應(yīng)對(duì)其他所有樣本類型進(jìn)行全性能評(píng)估。

2.3企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.4精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度、實(shí)驗(yàn)室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

采用臨床樣本或病毒培養(yǎng)物進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：不含待測(cè)物，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5包容性

2.5.1采用生物信息學(xué)方法對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)的包容性進(jìn)行研究，研究應(yīng)覆蓋已公布的寨卡病毒核酸序列。

2.5.2驗(yàn)證具有時(shí)間和區(qū)域特征性的不同來(lái)源的陽(yáng)性樣本，應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗(yàn)證。樣本應(yīng)覆蓋已知寨卡病毒的主要型別，包含對(duì)亞洲型、非洲型和其他重點(diǎn)型別各不少于3個(gè)不同來(lái)源的陽(yáng)性樣本（臨床樣本或病毒培養(yǎng)物）的研究。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

建議采用亞洲型和非洲型的流行株樣本系列稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復(fù)檢測(cè)，記錄不同濃度檢出的結(jié)果，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和分析方法，將具有95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。申請(qǐng)人可采用半數(shù)組織感染量測(cè)定法（TCID50）的方法進(jìn)行毒株濃度確認(rèn)，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式；也可采用空斑形成單位（PFU）的方式進(jìn)行毒株濃度的確認(rèn)，以PFU/mL作為毒株濃度的表示方式。除此之外，申請(qǐng)人還應(yīng)采用數(shù)字PCR、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法進(jìn)行毒株核酸濃度的確認(rèn)，以copies/mL作為毒株濃度的表示方式。

2.6.2檢出限的驗(yàn)證

選擇另外3例不同來(lái)源的寨卡病毒樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應(yīng)

需驗(yàn)證相關(guān)病原體和多例人類基因組DNA（表1）的交叉反應(yīng)。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高，提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體樣本的來(lái)源、陰陽(yáng)性、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

對(duì)于某些難以培養(yǎng)或因?yàn)樯锇踩詿o(wú)法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進(jìn)行交叉驗(yàn)證。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體核酸的來(lái)源、組成和濃度等信息，濃度可采用copies/mL單位表示。

表1 需進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的物質(zhì)

注：*標(biāo)注為可采用生物信息學(xué)分析的方法進(jìn)行研究的病原體。

2.7.2競(jìng)爭(zhēng)性干擾

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床上容易與寨卡病毒合并感染的病原體，如登革病毒等，在高濃度的情況下對(duì)低濃度（例如檢出限濃度）寨卡病毒核酸檢測(cè)的影響，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性干擾研究。

2.7.3干擾試驗(yàn)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對(duì)可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)包含臨界陽(yáng)性水平在內(nèi)的寨卡病毒樣本。對(duì)結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比添加干擾物質(zhì)前后的Ct值差異。檢測(cè)的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

表2 用于干擾試驗(yàn)的物質(zhì)

2.8核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對(duì)。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。

2.9反應(yīng)體系

2.9.1樣本采集和處理

2.9.1.1樣本采集方式的選擇

2.9.1.2樣本采集時(shí)間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

2.9.1.3樣本處理方式的選擇：研究產(chǎn)品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學(xué)滅活，化學(xué)滅活部分應(yīng)對(duì)常見(jiàn)的消毒劑的適用性進(jìn)行研究。研究樣本前處理方式，包括對(duì)不同樣本類型的離心條件的確定研究等。

2.9.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測(cè)靈敏度。

提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。對(duì)于開瓶穩(wěn)定性研究應(yīng)模擬真實(shí)使用情形，包括開瓶穩(wěn)定性的開瓶頻次和開瓶時(shí)間等。

4.陽(yáng)性判斷值研究

陽(yáng)性判斷值一般為申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)病毒核酸陽(yáng)性的Ct值。陽(yáng)性判斷值研究用樣本來(lái)源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時(shí)間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽(yáng)性和高陰性水平的樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對(duì)各樣本類型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證。

提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來(lái)源機(jī)構(gòu)、檢測(cè)結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過(guò)程；如主要原材料源于外購(gòu)，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對(duì)和功能性試驗(yàn)等方式，對(duì)病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，其中序列比對(duì)包括與已公布寨卡病毒序列的比對(duì)，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對(duì)；功能性試驗(yàn)包括對(duì)不同來(lái)源、不同滴度的寨卡病毒核酸陽(yáng)性樣本，和不同的近緣病原體的檢測(cè)。通過(guò)篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗(yàn)等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對(duì)其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測(cè)的靶序列，可采用假病毒制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測(cè)的全過(guò)程，以對(duì)整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對(duì)照，可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請(qǐng)人需對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對(duì)待測(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽(yáng)性參考品：應(yīng)著重考慮不同來(lái)源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來(lái)源的5個(gè)病毒樣本。

陰性參考品：主要涉及對(duì)交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，建議包括登革病毒（DENV-1～DENV-4）、西尼羅病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒、基孔肯雅病毒、新型布尼亞病毒、漢坦病毒、漢城病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、丙型肝炎病毒 、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、?？刹《?、細(xì)小病毒B19；立克次體、鉤端螺旋體 、瘧原蟲；傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌等。

檢出限參考品：可采用95%陽(yáng)性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。

重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

該類試劑應(yīng)通過(guò)臨床試驗(yàn)路徑進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。臨床試驗(yàn)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

應(yīng)選擇具備相應(yīng)條件且按照規(guī)定備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)。寨卡病毒病屬于區(qū)域性傳染性疾病，建議申請(qǐng)人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區(qū)域開展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評(píng)價(jià)方案。在整個(gè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)體外診斷試劑和對(duì)比方法均應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.臨床試驗(yàn)方法

2.1與對(duì)比方法的比較研究

2.1.1申請(qǐng)人可采用試驗(yàn)體外診斷試劑與核酸序列測(cè)定（Sanger測(cè)序）方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法的一致性。同時(shí)還應(yīng)進(jìn)行部分與寨卡病毒分離培養(yǎng)鑒定的對(duì)比試驗(yàn)。以上兩方面評(píng)價(jià)結(jié)果結(jié)合起來(lái)共同論證試驗(yàn)體外診斷試劑的臨床性能。

臨床試驗(yàn)資料中應(yīng)對(duì)測(cè)序方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹，并提交性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)，證明測(cè)序方法與試驗(yàn)體外診斷試劑的可比性。如測(cè)序試驗(yàn)委托其他機(jī)構(gòu)完成，還應(yīng)提交由臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)委托第三方機(jī)構(gòu)/實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)試驗(yàn)的測(cè)序服務(wù)合同/協(xié)議，提交相關(guān)機(jī)構(gòu)資質(zhì)和選擇依據(jù)。

2.1.2 如有已上市同類產(chǎn)品，臨床試驗(yàn)亦可選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，對(duì)比試劑的選擇應(yīng)考慮樣本類型、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)體外診斷試劑具有良好的可比性。

2.2 與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究

在上述比較研究的基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人還應(yīng)采用試驗(yàn)體外診斷試劑與寨卡病毒病診斷的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑的臨床性能。寨卡病毒病診斷的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)可參考國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的現(xiàn)行有效的寨卡病毒病診療方案推薦的確診依據(jù)。

3.臨床試驗(yàn)受試人群的選擇

臨床試驗(yàn)的受試人群應(yīng)來(lái)自產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為寨卡病毒感染的疑似病例，申請(qǐng)人在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)應(yīng)依據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的現(xiàn)行有效的寨卡病毒病診療方案中對(duì)“疑似病例”的定義確定受試者入組標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)還應(yīng)入組部分需要進(jìn)行鑒別診斷的登革熱等其他黃病毒感染患者，以及細(xì)小病毒感染、風(fēng)疹、麻疹、腸道病毒感染、立克次體病等患者，對(duì)臨床特異度進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期適用人群和寨卡病毒病發(fā)病特征，臨床試驗(yàn)受試者中應(yīng)包含一定數(shù)量的孕婦和嬰幼兒受試者。此外臨床試驗(yàn)應(yīng)納入部分弱陽(yáng)性樣本。

4.臨床試驗(yàn)樣本類型

寨卡病毒核酸檢測(cè)可能涉及的樣本類型包括血清、血漿、唾液、精液和尿液等。臨床樣本的采集建議按照國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案執(zhí)行。

如申報(bào)產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，且經(jīng)分析和驗(yàn)證不同樣本類型之間幾乎不存在差異，例血清和血漿樣本，則臨床試驗(yàn)中不同樣本類型可進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)。如不同樣本類型在樣本基質(zhì)、干擾因素、被測(cè)物濃度水平等方面存在差異，例如血清/血漿與尿液、精液和唾液，則應(yīng)針對(duì)不同樣本類型分別進(jìn)行臨床性能評(píng)價(jià)，包括分別進(jìn)行樣本量的估算等。

5.臨床試驗(yàn)樣本量

臨床試驗(yàn)陽(yáng)性樣本和陰性樣本數(shù)量應(yīng)分別滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。針對(duì)與Sanger測(cè)序法或同類已上市產(chǎn)品的對(duì)比試驗(yàn)，可采用目標(biāo)值法公式分別估算最低陽(yáng)性和陰性樣本例數(shù)。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗(yàn)體外診斷試劑評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

其中陽(yáng)性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。臨床試驗(yàn)結(jié)果中，相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)的95%置信區(qū)間下限應(yīng)不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

與病毒分離培養(yǎng)鑒定的對(duì)比試驗(yàn)亦應(yīng)入組一定數(shù)量的培養(yǎng)陽(yáng)性及培養(yǎng)陰性病例，可采用抽樣精度的公式進(jìn)行樣本量估算。

與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比的比較研究，建議參考與上述與對(duì)比方法對(duì)比的樣本量估算方法，設(shè)定合理的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。

6.臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

臨床試驗(yàn)結(jié)果一般以四格表的形式進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計(jì)算試驗(yàn)體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對(duì)比方法的陽(yáng)性/陰性符合率及其95%置信區(qū)間。

臨床試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)對(duì)入組受試者的基本情況進(jìn)行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景等。特別應(yīng)針對(duì)用于特異性評(píng)價(jià)的各類受試者進(jìn)行歸類匯總，確認(rèn)入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗(yàn)中如涉及不同樣本類型，應(yīng)針對(duì)每種樣本類型分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（血清、血漿除外）。

臨床試驗(yàn)中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉(zhuǎn)歸等信息進(jìn)行充分的分析。臨床試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿足臨床要求。

7.境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的認(rèn)可

境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗(yàn)方案、報(bào)告和倫理審查意見(jiàn)，以及該數(shù)據(jù)適用于中國(guó)患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異的對(duì)比資料和臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異對(duì)于臨床試驗(yàn)結(jié)果影響的論證資料。

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗(yàn)技術(shù)審評(píng)要求，論證境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的充分性。

8.臨床證據(jù)的形式要求

申請(qǐng)人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機(jī)構(gòu)倫理審查意見(jiàn)、臨床試驗(yàn)方案、臨床試驗(yàn)小結(jié)、臨床試驗(yàn)報(bào)告以及臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。寨卡病毒核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書編寫應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1．【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測(cè)寨卡病毒病疑似病例、其他需要進(jìn)行寨卡病毒感染診斷或鑒別診斷者的XXX樣本（具體描述樣本類型）中的寨卡病毒RNA。

1.2有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照現(xiàn)行有效的《寨卡病毒病診療方案》及《寨卡病毒病防控方案》等文件執(zhí)行。

1.3簡(jiǎn)單介紹寨卡病毒病病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征以及臨床表現(xiàn)和現(xiàn)有診斷方法等。

1.4強(qiáng)調(diào)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)病情進(jìn)行綜合分析。

2.【檢驗(yàn)原理】

簡(jiǎn)述產(chǎn)品的核酸提取和RT-PCR原理。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號(hào)及注冊(cè)證號(hào)、備案號(hào)等信息。

4.【樣本要求】

4.1樣本的收集：分別明確推薦的不同樣本類型樣本的采集時(shí)間（如發(fā)病后7天內(nèi)）。需詳細(xì)描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，滅活方式，采樣體積，離心要求等。樣本的采集及處理方式若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。血漿樣本應(yīng)列明適用的抗凝劑類型。

4.2樣本的運(yùn)送與保存：描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性、運(yùn)送條件等。如聲稱樣本可以凍存，還應(yīng)明確凍融次數(shù)的限制。

5.【檢驗(yàn)方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽(yáng)性質(zhì)控品與待測(cè)樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機(jī)型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍，作為試驗(yàn)有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

6.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通過(guò)擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行結(jié)果陰陽(yáng)性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽(yáng)性、復(fù)測(cè)、無(wú)效等所有情形。

7.【檢驗(yàn)方法的局限性】

7.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

7.2有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析

7.2.1 如果樣本在運(yùn)輸、處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

7.2.2 試驗(yàn)環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

7.2.3 試驗(yàn)過(guò)程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

7.3.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存及處理、樣本中病原體含量過(guò)低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.2該病原體待測(cè)靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.3 未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

8.1國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和企業(yè)參考品的符合率。

8.2檢出限：簡(jiǎn)要介紹評(píng)價(jià)方法、所用樣本情況以及評(píng)價(jià)結(jié)果。

8.3對(duì)包容性的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

8.4對(duì)精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

8.5分析特異性

8.5.1交叉反應(yīng)：詳述交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類，及有/無(wú)交叉反應(yīng)的濃度水平。

8.5.2干擾試驗(yàn)：說(shuō)明驗(yàn)證的干擾物質(zhì)種類及有/無(wú)干擾反應(yīng)的濃度水平。

8.6臨床試驗(yàn)：簡(jiǎn)要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

9.【注意事項(xiàng)】

9.1臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室要求、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范。

9.2 試驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的試驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》及其他涉及到傳染性病原微生物的管理規(guī)定中的相關(guān)要求。

9.2試劑保存運(yùn)輸及使用過(guò)程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運(yùn)輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測(cè)過(guò)程操作不規(guī)范等，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

9.3避免實(shí)驗(yàn)室污染的措施

三、參考文獻(xiàn)

1.《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)）[Z].

2.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號(hào)）[Z].

3. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì). 寨卡病毒病診療方案（2016年第2版）[Z]. 2016-03-17.

4. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì). 寨卡病毒病防控方案（第二版）[Z].2016-03-28.